染色体非整倍体是导致自然流产和体外受精中胚胎移植失败的主要原因，其发生率与母体年龄密切相关。对有生育需求的高龄女性进行PGT-A检测，筛选整倍体胚胎移植，能够有效降低流产率，提高妊娠率和活产率。

极体（Polar body，PB）活检、卵裂期胚胎活检以及囊胚期滋养层细胞活检是PGT取材的主要方法。与另外两种方法相比，极体活检具有对胚胎损伤小、伦理上易被接受、胚胎利用率高以及能够实现新鲜胚移植等特点[1]。但既往研究发现，极体活检的PGT-A在大多数临床环境中不具有成本效益。随着纳米孔测序技术的快速发展，测序质量的显著提高，基于此的极体PGT-A将会成为未来的首选吗？

 

近期，《Clinical Chemistry》（IF=9.300）和《Journal of Assisted Reproduction and Genetics》（IF=3.100）先后发表了题为“Evaluation of Nanopore Sequencing on Polar Bodies for Routine Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy”、“Aneuploidy detection in pooled polar bodies using rapid nanopore sequencing”的两篇文章，深入探讨了基于纳米孔测序技术的极体非整倍体检测在临床中的应用价值，快来一睹为快吧！

 

PART 01

纳入20例患者的102份混合PB样本，比较基于常规aCGH以及基于纳米孔测序的PGT-A检测结果[2]。研究设计如图1所示，纳米孔测序工作流程如图2所示。

图1：研究设计（包括研究中发现的一致性）。PGT-A：胚胎植入前非整倍体遗传学检测；aCGH：微阵列比较基因组杂交；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值。

图2：纳米孔测序工作流程的示意图概述，包括嵌入临床PGT-A工作流程中的各个操作的时间测量。根据6个混合样本的中位测序时间计算每个样本的比例测序时间。ICSI：卵胞质内单精子注射；PB1：第一极体；PB2：第二极体：WGA：全基因组扩增。

 

纳米孔测序与常规aCGH分析的比较

共有99个样本质量合格，被纳入分析。
01 共99个混合PB样本用于PGT-A检测（aCGH与ONT的比较）（图2）。其中，aCGH检出整倍体29个（29.3%），非整倍体70个（70.7%）。纳米孔测序检出整倍体32个和非整倍体67个，样本水平一致性为97.0%，灵敏度为0.957，特异性为1.0，阳性预测值（PPV）为1.0，阴性预测值（NPV）为0.906（图1）。
02 所有aCGH和ONT分析的结果列在表1中。3例aCGH检测为非整倍体的样本经纳米孔测序检测为整倍体。
03 在99例样本中，aCGH分析共检出195条非整倍体染色体，其中98条为三体，97条为单体，覆盖23对染色体。在aCGH和/或ONT中发现的所有受累染色体如图3所示。在染色体水平发现98.7%的一致性（2,273条染色体中的2,243条被一致鉴定为正常或异常），敏感度为0.896，特异性为0.995，阳性预测值为0.940，阴性预测值为0.990。
04 通过纳米孔测序后的生物信息学数据分析流水线自动生成的整倍体和非整倍体检测样本的实例染色体分布图如图4所示。

图3：99例混合样本中整条染色体非整倍体的发生。TP表示在两种方法中都被检测到为非整倍体的染色体（TP重复或TP缺失）；FP表示aCGH正常而ONT异常的染色体（FP重复或FP缺失）；FN表示aCGH异常（FN重复或FN缺失）而ONT正常的染色体。“真阴性”（两种方法中的正常染色体）不显示。缩写：TP，真阳性；FN，假阴性；FP，假阳性。

图4：自动生成的纳米孔测序工作流程中的染色体分布图。对每个染色体的质量值噪声和MAPD进行了映射，并突出显示了总样本的阈值（分别为0.6和1.7）。缩写：MAPD：所有两两差异绝对值的中位数；噪声，每段内标准化阅读计数的中位数标准偏差。

 

表1：ONT与aCGH检测结果比较

 

核酸内切酶消化

评估核酸内切酶消化步骤的重要性。虽然高信噪比的样本显示出匹配结果，但额外的消化明显降低了噪声，并提高了对具有挑战性的案例的CALL出。

 

时间和经济成本效益

01 ONT工作流程在1.5h内可完成一个样本的测序（从扩增的DNA到倍性结果），大约12小时内可完成12个样品的分析，具有更快的处理速度。此外，ONT方法的优势在于其动态分辨率的调整能力，这使得它能够更灵活地生成针对含有三个染色体拷贝的极体样本的详细报告，这是传统aCGH方法所不具备的。
02 整个工作流程的材料成本，包括WGA、样品制备、测序和数据分析，每个样品从110美元到240美元（100欧元到220欧元）不等。

 

PART 02

纳入102个混合PB样本，比较基于常规aCGH以及基于纳米孔测序的PGT-A检测结果[3]。两种方法工作流程示意图，如图1。

图1：两种方法的工作流程示意图：微阵列比较基因组杂交（aCGH）和牛津纳米孔技术（ONT）。这两种技术的初始步骤都是极体活检和全基因组扩增（WGA），然后是特异性文库的制备和倍性分类和拷贝数变异（CNV）分析。

图2：比较两个样本的aCGH和ONT倍性分析。根据aCGH的平均log2比值阈值进行的倍性分类，以及报告的临床评估或利用ONT进行的计算机倍体分类。（a）使用aCGH对CNV状态进行全基因组分析。（b）使用aCGH检测每条染色体的平均log2比值（WGA扩增的样本与对照DNA）。浅灰色条表示与雄鼠对照的信号分布，深灰色条表示与雌鼠对照的信号分布。汇集极体的重复（橙色线表示）和缺失（蓝色线表示）的阈值。（c）使用ONT进行全基因组CNV分析。黑点表示大约1 Mb的每个可变宽度bin的总读计数。黄色线表示重复，紫色线表示缺失。（d）使用ONT绘制每条染色体的装箱读片计数箱线图。彩色线显示预期读取计数。黄色线表示重复的预期读取计数，紫色线表示缺失的预期读取计数。

 

 

非整倍体检测—ONT vs. aCGH

01 整个基因组的信号模式在视觉上相似，每条染色体的平均值也相近（图2）。
02 96%（98/102）的样本的倍性检测结果（整倍体、非整倍体）一致。4个不一致样本（ID023、ID028、ID062、ID072），aCGH归类为整倍体，而ONT归类为非整倍体（表1）。而最终临床评估显示，只有两个样本（ID023和ID062）的结果与ONT不同，另外两个样本（ID006和ID063）的临床评估为不确定。

表1：两种方法倍性分类的样本数交叉表

（蓝色：一致；红色：不一致）

每条染色体的非整倍性统计

01 基于aCGH分析的2,346条染色体中，92.5%（2,169/2,346）的染色体倍性分类结果与ONT一致。aCGH检测的94.0%（47/50）染色单体重复、93.7%（2,032/21,68）整倍体和70.3%（90/128）的染色单体缺失与ONT分类的结果一致（表2）。
02 少数样本染色体倍性分类不一致率高。大多数样本中ONT数据的基线与aCGH数据处于不同的水平。例如，对于样本ID016，将ONT基线与aCGH基线相比较，使差异从17条染色体减少到仅1条染色体（图3b，d，f）。因此，排除了超过一半染色体为非整倍体的8个样本，使用ONT进行进一步的一致性分析。除了上述8个样本，每条染色体的一致性增加到97.7%（2113/2162）（表3）。
03 总体而言，使用ONT的非整倍体染色体数目高于aCGH（150 vs. 131）。在两种方法中，染色单体缺失的总数（ONT：84，aCGH：83）均高于染色单体重复的总数（ONT：66，aCGH：48）（图4）

 

表2：两种方法用于特定倍性分类的染色体数目交叉表（蓝色：一致；红色：不一致）

 

表3：过滤高度复杂样本后，两种方法用于特定倍性分类的染色体数目交叉表（蓝色：一致；红色：不一致）

 

部分重复和缺失

01 ONT工作流程可自动识别样本ID050的2号染色体的50 Mb重复，样本ID005的1号染色体约13 Mb的缺失，样本ID072的2p重复、7p缺失和Xq重复等微小畸变。通过可视化回顾全基因组分析结果，可以在aCGH数据中看到这些畸变（图3a、c、e）。

图3：片段性非整倍体检测（ID005）和基线偏移（ID016）。对于a-d和f，上述给出了使用ONT计算的倍性分类，或者基于aCGH的平均log2比值阈值进行的倍性分类，这与报道的临床评估一致。a,b.使用aCGH对两个样本的CNV状态进行全基因组分析。c,d. 利用ONT进行全基因组CNV分析。黑点表示大约1 Mb的每个可变宽度bin的总读计数。黄色线表示重复，紫色线分别表示缺失或双倍缺失。e.上述CNV分析的单染色体视图（样本ID005）显示1号染色体的部分缺失。f. 使用ONT进行全基因组CNV分析，样本ID016的数据集减少到300 k reads

 

图4：每种方法的染色体重复和缺失的绝对数量，包括94个样本（高度复杂的样本被过滤）

 

所需的读取次数和工作流程时间

01 aCGH的工作流程大约需要24小时，包括16小时的过夜杂交步骤。ONT的工作流程可以在相似的时间内对大约1 M的读数进行测序和分析。如果计划进行新鲜胚胎移植，工作流程时间很重要。为了模拟更短的测序时间，将reads的数量随机降采样到300 k，实现了大约5 h的测序时间（图1）
02 在分析缩减后的数据集后，相对于原始ONT结果，每个样本的倍性分类结果相等，只有两个样本的21号染色体缺失小于染色体长度的一半，因此预测不为缺失，而在另一个样本中，与原始结果和aCGH评估不同，使用缩减后的数据集将倍性分类分配为非整倍体。

 

总   结

• 与aCGH相比，纳米孔测序具有更多的优势，包括（但不限于）检测快速、测序价格低廉以及所需的初始投资成本。

• ONT方法在检测极体的染色体倍性和微重复或缺失方面展现了明显优势，特别是在考虑到汇集的极体中存在三个染色体的情况下。

• 相较于标准的商业aCGH方法，ONT技术能够更准确、高效地评估染色体状态，为PGT-A提供了一种新的、更优的检测方案。

 

参考文献

[1] 陈佳, 伍琼芳. 极体活检在胚胎植入前遗传学检测中的临床应用价值[J].中华生殖与避孕杂志, 2022, 42(11):6.DOI:10.3760/cma.j.cn101441-20220831-00374.

[2] Oberle, A., Hanzer, F., Kokocinski, F., Ennemoser, A., Carli, L., Vaccari, E., Hengstschläger, M., & Feichtinger, M. (2024). Evaluation of Nanopore Sequencing on Polar Bodies for Routine Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy. Clinical chemistry, hvae024. Advance online publication. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvae024

[3] Madritsch, S., Arnold, V., Haider, M., Bosenge, J., Pfeifer, M., Weil, B., Zechmeister, M., Hengstschläger, M., Neesen, J., & Laccone, F. (2024). Aneuploidy detection in pooled polar bodies using rapid nanopore sequencing. Journal of assisted reproduction and genetics, 10.1007/s10815-024-03108-7. Advance online publication. https://doi.org/10.1007/s10815-024-03108-7